Группа аналитической термооптической спектроскопии

При исследовании твердых образцов, термолинзовая спектрометрия позволяет работать с более жестко сфокусированными лучами, чем в случае растворов. Вследствие этого, появляется возможность дополнительного увеличения чувствительности термолинзовых измерений, а также использовать ТЛС как метод локального анализа. Кроме того, в этих условиях возможно достаточно точно рассчитать площадь сечения лазерного луча, то есть оценить не только концентрационные, но и абсолютные пределы обнаружения на поверхности.

Все исследования делятся на две большие (частично пересекающиеся) группы

1. исследование термодинамики и кинетики процессов сорбции на уровне нанограммовых и субнанограммовых содержаний реагирующих компонентов при помощи термолинзовой спектрометрии, спектроскопии фототермического отклонения и родственных ей методов.
2. Исследования привитых монослоев на поверхности стекла и кварца.

При решении первой задачи, в случае сорбентов с большой емкостью, ТЛС использована как метод определения следовых остаточных концентраций в растворе, а спектроскопия фототермического отклонения — как комплементарный метод определения сорбированного вещества на сорбенте. Показано, что воспроизводимые измерения при помощи обоих методов возможны вплоть до концентраций порядка нмоль/см 2 . Сорбционные равновесия параллельно изучаются при помощи традиционной спектрофотометрии, инверсионной вольтамперометрии и спектроскопии диффузного отражения.

При решении второй задачи, термолинзовая спектрометрия (514.5 нм) применена для прямого количественного определения красителей, ковалентно привитых на планарную поверхность стекла вплоть до монослоя (диапазон 1–10 слоев красителя). Возможно исследовать кинетику фотодеструкции привитого красителя под воздействием лазерного излучения. ТЛС может быть использована для оценки сплошности привитого слоя в масштабе, соответствующем линейным размерам термолинзы (10–60 мкм). Сканирующая спектроскопия фототермического отклонения (ИК, 1046 нм) использована для оценки общей толщины привитого слоя (красителя + модификатора) до уровня 1 нм (предварительная оценка).

Термооптические исследования сплошности и толщины привитых слоев подтверждаются параллельными измерениями методами растровой электронной микроскопии и Оже-спектроскопии (в режиме вторичной электронной эмиссии).

Используемые методы

Термолинзовая спектрометрия

Спектроскопия термооптического отклонения

Растровая электронная микроскопия

Оже-спектроскопия

Инверсионная вольтамперометрия

Спектроскопия диффузного отражения

Исследования можно разбить на две большие части:

1. Разработка методик (прежде всего, спектрофотометрических с возможным последующим выходом на термооптическое детектирование) биологически активных и (или) важных для медицины и фармакологии веществ, для которых не существует методов определения на уровне нг/мл и ниже. Прежде всего, это пирогены фенацетинового ряда, входящие в состав и (или) загрязняющие лекарственные препараты типа парацетамола.
2. Исследования липополисахаридов (ЛПС) как эндотоксинов. Основная задача, в свою очередь, распадается на следующие направления:
1. Исследования структуры ЛПС и ее связи с пирогенными свойствами, то есть прогнозирование того, какие ЛПС являются эндотоксинами.
2. Разработка методик фотометрического определения ЛПС на уровне нг/мл или ниже. Соотнесение чувствительности и селективности разрабатываемых химических методов с биологическими тестами (тесты на животных, ЛАЛ-тест). Наиболее важная часть этой задачи — обеспечение селективности определения ЛПС (на фоне полисахаридов, липидов, нуклеиновых кислот). В данном случае речь идет как о поиске общих подходов к разработке чувствительных и селективных методов определения ЛПС, так и о разработке методик на конкретные ЛПС, например, E . Coli , Salmonella Typhi (с возможным выходом на валидацию методик)
3. Поиск возможности нефотометрического определения ЛПС (например, по коллоидным свойствам их растворов), попытка использовать «принцип Бертильона» (совокупность нескольких индивидуально неселективных признаков может являться селективным признаком) и определения эндотоксинов на фоне ЛПС, не проявляющих свойства эндотоксинов.

Достигнутые результаты в биомедицинских исследованиях

Разработаны термолинзовые методы определения теофиллина в нервных клетках по реакции образования производной амалиновой кислоты (предел обнаружения 2 × 10^–9 M ) и ацетилхолина дипикриламином, основанный на экстракции образующегося ионного ассоциата дихлорметаном (предел обнаружения 6 × 10 ^–9 M ).

Разработаны методики определения п-аминофенола в парацетамоле, характеризующиеся минимальным матричным эффектом: спектрофотометрическая (предел обнаружения 2 мкг/мл, нижняя граница определяемых содержаний 10 мкг/мл, относительное стандартное отклонение определений в диапазоне 20–200 мкг/мл не превышает 25%) и термолинзовая (предел обнаружения 0,05 мкг/мл, нижняя граница определяемых содержаний 0.15 мкг/мл, относительное стандартное отклонение измерений в диапазоне 0.3–20 мкг/мл не превышает 10%). Проведено термолинзовое определение п-аминофенола в серийных образцах парацетамола производства ОАО "Фармакон" (Н. Новгород, Россия): содержание п-аминофенола 0,002 масс. %, относительное стандартное отклонение определения 5 %. Метод характеризуется высокой чувствительностью, быстротой отклика аналитического сигнала, простотой исполнения.

ЛПС. Оптимизирована фотометрическая методика определения полисахаридов при помощи фенола в среде конц. серной кислоты. Определены условия определения модельных полисахаридов по этой реакции при помощи спектрофотометрии (пределы обнаружения 5–30 мкг/мл) и термолинзовой спектрометрии (пределы обнаружения 2–5 мкг/мл). Оптимизированная методика применена для оценки суммарного содержания пирогенных липополисахаридов в препарате "Пирогенал". Предел обнаружения 0,3 мкг/мл, что на порядок ниже диапазона концентраций, используемых для инъекций.

Предложены условия спектрофотометрического определения ЛПС по всем трем основным фрагментам их молекул – полисахаридному (образование ионных пар с метиленовым голубым), липидному (образование ионных пар с карбоцианиновым красителем Stains - all ) и 2-кетодезоксиоктоновой кислоте (КДО, по реакции образования хромофора с тиобарбитуровой кислотой). Для всех трех случаев пределы обнаружения ниже 1 мкг/мл. В случае КДО, применение термолинзовой спектрометрии позволило достичь чувствительности, сопоставимой с современными биотестами на ЛПС (предел обнаружения 70 нг/мл). На заключительном этапе проведено термолинзовое определение ЛПС по КДО с тиобарбитуровой кислотой в стандарте эндотоксина, выделенного из бактерии E . Coli и используемого для стандартизации биотестов . Полученные данные подтверждают правильность разработанной методики в области субмикрограммовых количеств ЛПС.

ВЭЖХ ( совместно с лабораторией хроматографии и ИФМ РАН (Нижний Новгород)) . Разработка фазового (интерферометрического) фототермического детектора на основе поляризационного интерферометра. Основные достоинства — наивысшая чувствительность среди всех фототермических методов и возможность одновременного детектирования сдвига фаз для окрашенных веществ (за счет изменения оптического пути вследствие изменения температурного градиента показателя преломления, фототермический детектор), так и веществ, напрямую изменяющих показатель преломления (рефрактометрический детектор) Предложенная схема опробована на модельных смесях (сахара в рефрактометрическом варианте, комплексы металлов с ПАР в фототермическом варианте).

КЗЭ (совместно с Кассельским университетом и научным центром Карлсруэ (FZK) (Германия). Разработка детектора для капиллярного электрофореза на основе скрещенно-лучевого термолинзового детектора в ближней зоне (условия дифракции Френеля). На настоящий момент проведена оптимизация оптической схемы для двух прототипов детектора (для длин волн индуцирующего лазера 257 и 325 нм) и определены метрологические характеристики ряда веществ (порядка n × 10^–10 – n × 10^–9 М)

Работа направлена на исследование термодинамики и кинетики реакций комплексообразования, окисления-восстановления, осаждения-растворения, а также процессов сорбции и экстракции на уровне нанограммовых и субнанограммовых содержаний реагирующих компонентов при помощи термолинзовой лазерной спектрометрии и родственных ей методов. К настоящему времени проведены исследования термодинамики и кинетики аналитических реакций некоторых переходных металлов (Fe(II,III), Co (II), Ni(II,III), Cu ( I , II ), Bi ( III )) при помощи термолинзовой спектрометрии. В результате этих исследований достигнуты успехи при определении констант устойчивости комплексных соединений (12 систем металл–лиганд), констант скорости реакций, произведений растворимости, энергий активации кинетических процессов на уровне n ? 10 –8 – n ? 10 –7 M . Большинство данных получено впервые (в частности, ступенчатые константы устойчивости для некоторых прочных комплексов), при этом показано, что в ряде случаев термолинзовые методы обладают преимуществом не только в чувствительности, но и в селективности и воспроизводимости по сравнению с существующими методами (спектрофотометрия, ИСЭ). Аналитические возможности ТЛС продемонстрированы при разработке методов определения металлов (Bi, Co, Cu, Fe, Mo и Ni) с пределами обнаружения на уровне 10 –9 М.

Кинетические методы могут предоставлять новые возможности для термолинзовой спектрометрии, но они практически не исследованы. Мы пытаемся ответить на следующие вопросы:

•  Очевидно, что термолинзовая спектрометрия обеспечивает высокую чувствительность измерений. Однако важно понять, для каких систем этот выигрыш оправдан, несмотря на усложнение пробоподготовки и самого процесса измерений. Иными словами, насколько термолинзовое детектирование необходимо в кинетических методах анализа?

•  Кинетические методы используют иные аналитические сигналы нежели прямые фотометрические измерения (наклон кинетических кривых и т. п.). Необходимо оценить, как это скажется на методологии термооптического эксперимента, метрологических характеристиках и т. д. Иначе говоря, перспективно ли использование кинетических зависимостей в термолинзовой спектрометрии?

•  Наконец, в термолинзовых кинетических экспериментах обе составляющие могут значительно влиять друг на друга, приводя к новым эффектам. Необходимо понять, можно ли прогнозировать, контролировать, или использовать эти эффекты при разработке новых методов анализа. Иными словами, существуют ли возможности термолинзовой спектрометрии более широкие, чем просто приема высокочувствительного детектирования в кинетических методиках .

Разработана методика оптимизации оптической схемы термолинзового спектрометра, позволяющая в несколько раз сократить время на юстировку схемы и обеспечивающая расширение диапазонов определяемых содержаний в 2-5 раз. Определены основные параметры термолинзового спектрометра для вариантов параллельно-лучевой ТЛС, скрещенно-лучевой ТЛС для «макро»-условий (размер элемента > 10 мкм) и микро-условий. целом, как для капилляров так и каналов микрочипов достигнуты высокая чувствительность термолинзовой спектрометрии, а проведенная оптимизация оптической схемы позволяет обеспечить хорошую воспроизводимость измерений. Полученные данные могут быть использованы при создании компактных систем микроанализа на основе микрофлюидных чипов с малым расходом реагентов и количеством отходов.

Проведено моделирование формирования сигнала в традиционной термолинзовой спектрометрии (в дальней области) и термолинзовой спектрометрии в ближней области (условия дифракции Френеля) и показано, что первый метод более предпочтителен при исследовании быстрых процессов (определение кинетических параметров реакций, использование в варианте двумерных микропотоков и интегрированных систем микроанализа), а также при исследованиях поверхностно-поглощающих образцов, в то время как термолинзовая спектрометрия в ближней области выигрывает в чувствительности и воспроизводимости при исследованиях в микро-ВЭЖХ, капиллярном электрофорезе, а также при исследовании объемно-поглощающих образцов малого объема (менее нл).

1) Получены результаты сравнительного анализа (оценки) чувствительности пяти основных методов термооптической спектроскопии – термолинзовой спектрометрии в дальней области, термолинзовой спектрометрии в ближней области (фототермической рефрактометрии), термолинзовой микроскопии, фототермической интерферометрии и спектроскопии фототермического отклонения – при исследовании растворов, поверхностей раздела фаз жидкость-жидкость, поверхностей адсорбентов с малой емкостью (кварц, стекло) и микропотоков.

2) Исследованы метрологические характеристики термооптических методов: инструментальная чувствительность, воспроизводимость, зависимости от геометрических факторов, природы растворителя и характеристик лазеров. Сравнены условия термооптического детектирования в классическом варианте, капиллярах и микрофлюидных чипах и предложены оптимальные инструментальные настройки приборов.

3) Выведено общее уравнение инструментальной погрешности термолинзовых измерений, которое позволяет определять оптимальные режимы работы термолинзовых спектрометров в варианте традиционных термооптических измерений, а также в варианте спектроскопии фототермической деформации при аналитических определениях в растворах, условиях потока и поверхностно-поглощающих твердых образцов, а также при определении фундаментальных параметров (констант устойчивости комплексов, констант скорости, констант адсорбции и др.). Исследованы факторы, влияющие на правильность определения. Изучены источники шумов (лазерные источники, шум мерцания, конвекционные шумы и шумы потока), а также оценены потенциальные эффекты излучения зондирующего лазера на времяразрешенные и равновесные термолинзовые (в том числе и микроскопические) измерения.

4) Выведено уравнение, позволяющее оценить предел обнаружения термолинзовых измерений, основанное на учете инструментальной погрешности измерений, степени завершенности реакции и характеристиках полосы поглощения реагента. Показано, что о птимальные условия измерения при термолинзовом детектировании определяются не только поглощением определяемого соединения и реагентов, но и собственным поглощением растворителя на рабочей длине волны.